第二生化マニュアル目次
当教室で行われている主な蛋白定量法は、１）紫外吸収法、２）Bradford法、３）Lowry法の三つである。三者にはそれぞれ、長所、短所がある。また、同じサンプルでも定量法によって、結果に大きな差が見られることも多い。よって、それぞれの特徴を知り、一連の実験では統一された測定法を行うことが望ましい。
１）紫外吸収法
（原理）280 nmにおけるチロシン、トリプトファンの吸収を測定。
（長所）操作が簡便、サンプルの回収が可能。
（短所）蛋白質によって吸光係数の差が大きい。核酸など、他に吸収を持つ物質があると不正確になる。
（定量範囲）100-1000 μg/ml
（測定法）吸光計にて280 nmの吸光を測定する。A280=1.0=1 mg/mlとして計算。A280/A260 <1.5
の時は核酸の混入が考えられるので、他の方法を検討すべきである。
２）Bradford法
（原理）クマージーブルーが蛋白質と結合する際の吸光の変化を測定。
（長所）操作が簡単、妨害物質が少ない。
（短所）蛋白質によって発色率に差がある。界面活性剤の混入により不正確。
（定量範囲）25-200 μg/ml (5倍希釈液使用時）、5-25 μg/ml （原液使用時）
（測定法）
(5倍希釈液使用時）
96穴のプレートにバックグラウンド（通常は水かバッファーを使用）, スタンダード（私はBSA を使用）、サンプル液を20 μl
ずつ入れ、これにBiorad protein assay dye reagent の5倍希釈溶液を200 μlずつ加える。バックグラウンドとの吸光の差を595
nmで測定し、スタンダードから描いた標準直線（になるはず）から蛋白濃度を求める。サンプル液が濃いときは、適当に希釈する。
（原液使用時）
エッペンドルフチューブにバックグラウンド（通常は水かバッファーを使用）, スタンダード（私はBSA を使用）、サンプル液を800
μl ずつ入れ、これにBiorad protein assay dye reagent の原液を200 μl ずつ加える。
（注意）
実はBSAは、この方法では発色率が高いので、Bradford法のスタンダードとしては不適当です。（しかし、世界的にも使用されているのが不思議）なお、スタンダード、サンプルともにduplicateで行うのが望ましい。
３）Lowry法
（原理）フェノール試薬とが蛋白質（チロシン、トリプトファン、システイン） と結合する際の吸光の変化を測定。
（長所）感度が高い。
（短所）妨害物質が多い。蛋白質によって発色率に差がある。時間がかかる。
（定量範囲）5-100 μg/ml
（測定法）
＠ストック試薬
(a) 2% Na2CO3 in 0.1 N NaOH
(b) 0.5% CuSO4･5H2O (in 1% 酒石酸ナトリウム）
(c)1 N フェノール試薬（2N Folin and Ciocalteu reagentが市販）
(d)アルカリ性銅溶液（用時調整）(a) 5 ml +(b) 0.1 ml
96穴のプレートにスタンダードとバックグラウンド（通常は水かバッファーを使用）、サンプル液を20 μl ずつ入れ、これに(d)を100
μl ずつ加え、室温で10分放置する。(c)を10 μl ずつ加え、30分放置。バックグラウンドとの吸光の差を750 nmで測定し、スタンダードから描いた標準直線（逆対数グラフ）から蛋白濃度を求める。筆者は使用したことがないが、Bioradからキットが発売されている。
４）スタンダードの作成法
微量天秤でおよその質量を計り、吸光計で正確に合わせる。通常1 mg/mlのストックを作る。1 mg/ml溶液の280 nmにおける吸光度はBSA
0.63, Ovalbumin 0.75である。
（参考文献）
新生化学実験講座１ タンパク質 １ p85-107
ラボマニュアル遺伝子工学 増補版 p134-135
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