ウェスタンブロッティング（和泉孝志）

１.はじめに

通常ＳＤＳーＰＡＧＥ後、メンブレンフィルターに吸着させたタンパク質を特異抗体を用いて検出する方法である。ブロッティング方法として(1)水槽型、(2)セミドライ型があるが、ここでは操作が簡単で速いセミドライ型について述べる。検出方法としては、２次抗体の種類によって、(1)AP(アルカリフォスファターゼ)法、(2)HRP(Horse Radish Peroxidase)法、(3)125I-Protein A法（抗体ではない、高感度）などがあるが、ここでは操作が簡単で基質の安全性の高いAP法について述べる。

２.用意するもの

　Ａ.泳動のすんだＳＤＳーＰＡＧＥゲル
　　泳動時に Rainbow Marker (Amersham RPN756) 5μlを同時に流しておくとマーカーとして、またブロティング効率の推定のために便利。

                myosin                    200    KD  	blue
                phosphorylase b            92.5  KD  	brown
                BSA                        69    KD  	red
                Ovalbumin                  46    KD  	yellow
                carbonic anhydrase         30    KD  	orange
                trypsis inhibitor          21.5  KD  	green
                lysozyme                   14.3  KD  	magenta

　Ｂ.メンブレン　1.ニトロセルロース（Amersham Hybond C 0.45 μetc.）
　　　　　　　　　　　操作が簡単でブロッキングも短くてよいが泳動しすぎる
　　　　　　　　　　　危険がある。バックがきれい。
　　　　　　　　２.ＰＶＤＦメンブレン（BIO-RAD etc）
　　　　　　　　　　　主にシークエンス用、ブロッキングを長くする必要あり。　　　　　　　　　　　泳動しすぎる危険はない。バックの発色あり。
　　　　　　　　　　　メタノール（数秒）、転写液（１５分）にて湿しておく
　　　　　　　　　　　必要がある。その後乾かしてはいけない。
　　ここでは１について述べる。

　Ｃ.泳動液　100ml
　　　　　　　10 x Tris-Glysin  　10 ml　(10x, 1l = 30 g Tris, 144 g Glysin)
              メタノール　　      20 ml
　　　　　　　水　　　　　　      70 ml
              10 % SDS            0.2 ml　
　　　　　　　（混合後３分ソニケート、長くしすぎると塩が析出する）

　Ｄ.ブロッキング液　(FCS 10-20%, BSA 1%, OVA 1%, or Skim Milk 0.5%)
　　Skim Milk が手軽で安い。ブロックエース(雪印製、大日本製薬)として市販。
　Ｅ.TBS (20 mM Tris-HCl pH 8.0, 0.15 M NaCl)
　Ｆ.T-TBS (TBS + 0.1 % Tween 20)
　　Ｅ、Ｆは洗浄瓶に入れておくと便利 (Stock: 20 x TBS, 10% Tween 20)
　Ｇ.AP反応液（100 mM Tris-HCl pH 9.5, 5 mM MgCl2, 100 mM NaCl）
　Ｈ.100 x AP基質液(a. NBT 50 mg/ml 70% dimethylformamide, b. BCIP 50 mg/ml 　　　dimethylformamide) 10 ml反応液にa液66μl,b液33μlを混ぜる。
　　（Ｇ、ＨはBIOｰRADからKitとして販売されている。）
　Ｉ.一次抗体液：Monoclonal Ab (1-5 μg/ml) Polyclonal Ab (100-1000 倍希釈)
　　titrationの必要あり。Monoclonal Abの場合 Culture Sup. をそのまま使用できることもある。希釈する場合はTBSBSA(1%)などで行う。NaN30.02%を入れておけば4℃保存で10回以上使用可能。
　Ｊ.AP標識二次抗体液。抗マウスヒツジ抗体、抗ウサギヒツジ抗体など。
　　市販。500-3000倍希釈。TBSBSAやTBS+1/10ブロックエースで希釈。
　Ｋ.Whatmann 3M paper
　Ｌ.ブロティング装置

３.手順

Ａ.ブロティング
1)ゲルの大きさに切ったＢ、Ｋ(４枚)を用意し、ゲルとともにＣにつけ３分振る。
2)図のように下から順番に気泡に注意しながらのせる。

3)最後に重い本（生化学辞典、シグマのカタログなどが重宝）を上におく。
4)200 mA(定電流)30-60分転写
　(10%ポリアクリルアミドゲルの場合、目的タンパク質の分子量にもよる)
5)メンブレンをTBSで洗う。ゲルは確認のために染色する。

Ｂ.抗体による検出
以後の操作は室温でのshakerによる震盪である。
1)ブロッキング。Ｄ液,15分
2)TBS,5分２回
3)一次抗体,1-2時間。または４℃ over night。
4)TBST,5分。TBS,５分２回。（一次抗体は回収して再使用）
5)２次抗体,30分-1時間
6)TBST,5分。TBS,５分3回。
7)AP反応液に基質を加えメンブレンを浸す。
8)発色してきたら(5-15分)、水でよく洗い、ろ紙上で乾かす。
9)光を避けろ紙にはりサランラップでカバーして保存する。

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