RNA抽出法（組織より）山本　寿子

RNA Extraction Kit (Pharmacia Biotech)　コード番号：27-9270-01
ファルコンチューブ
ヒスコトロンホモジナイザー
注射針 18 G　
シリンジ 30 ml
超遠心チューブ
2 M 酢酸カリウム
エタノール

＜実験方法＞
　抽出；

１、組織をとる20-30分前に、extraction bufferを37 ℃で保温した後、室温に戻す。
２、動物組織を抽出：組織をさいの目に刻み、組織1 g当たりextraction bufferを 18 ml 加える。（30 mlのファルコンチューブ使用）
３、冷やしたホモジナイザーで組織をホモゲナイズする。（熱や泡を最小限に！）
　5,000 x g for 20 min. at 15 ℃ （ベックマンJA-14ローター　6,750 rpm)
(4℃で遠心すると、グアニジンが析出するため）
　透明なSupernatantを移す。

４、30 ml シリンジに18 G 針を付け、Supを通し（10回以上）、ゲノムを切断して、　粘性を減少させる。

　超遠心；

　SW28.1ロータータイプの場合
　　　　　CsTFA : Sample loading = 8.5 : 8.0
（遠心チューブにおいてのvoluemの調整が必要な場合extraction bufferを用いる。）
５、CsTFA cushion の上にサンプルの適当量をやさしくのせたチューブをローター　に入れる。（チューブのバランスは、必ず電子天秤で行う。）
　125,000 x g for 16 hr at 15 ℃

　RNAの回収；

６、遠心チューブを取り出し、下のように底から1ｃｍ残してアスピレーターで液を　除いた後、逆さにして、5分放置する。（グアニジンの入った液 extraction bufferを捨ててしまうので, これ以降のRNaseのコンタミに注意する。）

７、逆さまにした状態で矢印のところで切るか、またはそこまでキムタオルで拭く。
　チューブを氷上において、250 μl TEbufferでRNAペレットをピペッティングして　とかす。
８、滅菌したエッペンドルフチューブに移して十分にvortexし、65 ℃ 10分インキュ　ベートする。　（この間も時々vortexする。）
９、最大回転数で10秒遠心し、Supをエッペンドルフチューブに移す。
１０、1/10 vol. 2 M KoAc と2.5 vol.EtOHを加え、-20 ℃ 2 hr 以上置く。
１１、5,000 x g for 20 min.で、遠心した後, Supを捨て、ペレットを乾燥させて、滅菌したMilliQ適量(またはTE buffer)で溶かす。　　　但し、ペレットを完全に乾燥すると溶けにくいので注意すること。

　RNA濃度の決定；
　
　吸光光度計にて、A260測定する
　 1 A260 unit= 40μg RNA/ml

　　　　(筆者は小腸1 gより1.2 mgのtotal RNAしか得られなかった。)
また、同時に200 ng-500 ngを泳動して、rRNAのバンドを確認すること。

　totalRNAからpolyA+RNAを精製する。

＜用意するもの＞
OligotexTM-dT30＜Super＞日本ロシュ
2XElution buffer (20 mM Tris-HCl pH 7.5, 2 mM EDTA, 0.2 % SDS)
5 M NaCl
Washing buffer (10 mM Tis-HCl pH 7.5, 1 mM EDTA, 0.5 M NaCl, 0.1 % SDS)
TE Buffer

＜実験方法＞

　１２、total RNA 500μg/tubeよりmRNAを精製する。

total RNA Xμl(500μg)
2X elution buffer 250μl
Milli Q水 ( 500-250-X) μl

全体で1x elution bufferになるようにする。

　１３、各々にOligotexＴＭ-dT 30＜Super＞ 0.5 mlを加え、65 ℃ 5 min.加熱後、on ice 　　　で、急冷して3 min.放置する。
　１４、５Ｍ NaCl 0.1 mlを加え、37 ℃ 10 min.インキュベートする。
　　　15,000 rpm 3 min. 遠心後、Supをピペットで除去する。
　１５、ペレットにWashing Buffer 1.25 ml加え、ピペッティングにより完全に懸濁する。
　　（SDSにより泡が発生するので、初めは少量のbufferを加えピペッティングした　　　後、1.25 mlに調整する。）
　１６、15,000 rpm 3 min. 遠心後Supをピペットで除去する。
　１７、ペレットをTE Buffer 0.5 ml加え, 完全に懸濁する。
　１８、65 ℃ 5 min.加熱後、on ice 3 min.
　１９、15,000 rpm 3 min. 遠心後、Sup(polyA+ RNA)を回収する。
　２０、それに1/10 vol.KoAc , 2.5vol.EtOHを加え、-80 ℃ 2 hr エタ沈する。
　２１、15,000 rpm 20 min.遠心後、Sup捨て、70% EtOHでwashする。
　　　ペレットを100 μl TEに溶かす。
　２２、吸光光度計にてpolyA+RNAの、濃度をチェックする。
　　(筆者は小腸においてtotal RNA 500 μgから、14.2 μgしか回収できなかった。)
　２３、エタ沈して-80 ℃で保存し、目的の必要に応じた量を用いる。

mRNA抽出法(組織からdirectに抽出する方法)　　　　　　　　　　　山本　寿子

この方法は簡便だが、totalRNA→mRNAとStepwiseに精製する方法に比較して、 RNaseの混入は多いように思われる。従って、RNase量の多い臓器（肝、腎）には、適当でないことがある。また、エタ沈での保存も切れやすいため、早めの使用が望ましい。（長期保存には、向かない。）

＜準備するもの＞

・Quick Prep Micro mRNA Purification Kit (Pharmacia Biotech) コード番号：27-9255-01
・ファルコンチューブ
・ヒスコトロンホモジナイザー
・注射針 18 G
・シリンジ　30 ml

＜実験方法＞
１、組織0.2 gをはかりとり、Extraction Buffer 0.8 ml 入った10 ml用ファルコンチュー　　ブに入れて、よくホモジナイズする。
２、Elution Buffer 1.6 ml を加えて、よくホモジナイズする。( その後この Bufferは　　 65℃にしておく。）
３、18 G針をつけた30 mlシリンジでゲノムを切る。(10回以上通す)
　 8,000xg 1min.遠心する。
ここでOligo(dT)-Cellulose1mlを入れたエッペンドルフチューブも 1min. 遠心する。その後Supを除く。
４、透明なSup1mlをセルロースペレットにのせピペットで、懸濁する。（小さい　塊ができても無視してよい）次にチューブを3min.転倒混和する。　
５、16,000 x g 10 sec. 遠心し、Supを除く。
６、High-Salt Buffer1 mlを加え、チューブを転倒混和にて、懸濁する。次に、16,000 x g 10 sec. 遠心し、Supを除く。
７、６、を4回繰り返す。
８、Low-Salt Buffer 1 mlを加え、チューブを転倒混和にて、懸濁させる。次に、16.000xg 10 sec. 遠心し、Supを除く。
９、８、を１回繰り返す。
１０、Low-Salt Buffer 0.3 mlを加え懸濁させ、そのスラリーをMicro Spin Column(下にエッペンドルフチューブをおいたもの）に移す。
　フルスピードで 5 sec. 遠心する。
１１、エッペンに、貯まった液を捨て、Low-Salt Buffer 0.5 mlを再びカラムに加え、フルスピードで5 sec.遠心する。（セルロースペレットをこわさないように！）１２、１１、を２回行う。
　滅菌したエッペンドルフチューブの上に、カラムを置き遠心機にセットする。そして、65℃に温められたElution Buffer 0.2 mlをレジンの上に置き、フルスピー　ドで５秒遠心する。
１３、さらに、0.2mlのElution Bufferを加え遠心する。
　溶出したmRNAを含むチューブはon iceにしておく。
１４、吸光光度計にて、A260測定する。
　 1A260unit=40μgRNA/ml
１５、エタ沈して-80℃で保存し、目的に応じた量を用いる。
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RNA抽出法（組織より）山本 寿子

RNA抽出法（組織より）山本　寿子