第二生化マニュアル目次
1. Materials

• ・Serum-free medium
• ・Tyroad Solution with 10 mM HEPES-NaOH(pH7.4)
• ・Fatty Acid-free BSA
• ・[3H]Arachidonate
• ・Agonists
• ・2% (w/v) Triton X-100

2. Assay steps（12 well dishの場合）

Cells on 12 well dish
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Wash the cells once with 1.25 ml of 37℃-prewarmed serum-free medium
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Add 0.75 ml of serum-free medium containing 0.1 μCi of [3H]Arachidonate
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Overnight labeling in CO2-incubator
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Wash the cells twice for 3 min each with Wash buffer (Tyroad Solution with HEPES containg 0.1% f.a.-free BSA)
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Add 500 μl of Wash buffer and incubate for 3 min
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Add 5 μl of Wash buffer containing agonists
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Incubate for appropriate periods under 37℃
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Aspirate 250 μl of the sup with a pipetman → count the radioactivity (for released radioactivity)
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Add 250 μl of 2% Triton X-100
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Solubilize the cells with shaking
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Take 5 μl of the lysate → count the radioactivity (for incorporated radioactivity)

3. Points

• ・細胞の生きを改善するためにOvernightラベル時に、f.a.-free BSAを0.1%程度入れておいてもよい。細胞をまく密度、ラベル量、ラベル時間は、各自実験の目的・細胞に合わせて検討の必要がある。
• ・washの際に、細胞を乾燥させないようにする。
• ・非常にはがれやすい細胞の場合は、回収した上精を遠心で一度落としてから上精をとるか、最初からはがして行う。後者は浮遊細胞でのアラキドン酸遊離測定の場合と同じことになる。その場合、Washの操作は遠心にて行う。
• ・すべての実験は37℃下で行う。
• ・活性は取り込まれた量あたりの放出量で表示する。
• ・必要に応じて、アラキドン酸以降の代謝産物を同定できる。

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