以下のプロトコールはCHO細胞の場合です。当然ながら細胞によってRhodamineの濃度や条件は変わります。

(試薬など)

Rhodamine Phalloidin (Molecular Probe, R-415, 300Uを1.5 mlのMethanolに溶解。200 U/ml。遮光保存)

PBS (-)

PBS(-)+3.7 % ホルマリン

PBS (-) 0.1% Triton X-100

(プロトコール)

以下CHO-LTBR細胞をLTB4で刺激した実験。8 well/slideglass chamber

1)細胞をFN coat (13.3 micro g/ml PBS)したchamberにはやす。serum sarvation for O/N.

2)細胞をF12, FCS(-)でwash, 100 micro lのF12, FCS(-)を重層。

3)Ligandで一定時間刺激後、等量のPBS(-)+3.7 % ホルマリンで固定。(37℃ 30分)

4)aspirationで培地をのぞく。

5)PBS (-) 0.1% Triton X-100で薄めたRhodamine Phalloidin で染色。(室温 30分)　Rhodamine Phalloidinは4 U/ml-20 U/ml(50-10倍希釈)で良好な染色が得られた。

6)PBS (-) で3回洗う。

7)蛍光顕微鏡で観察。(Ex. 541 nm, Em. 565 nm)