準備するもの
・RPMI1640 -NIPUROの液体培地を用いている。
10% FCS
0.1 mM MEM non-essential amino acid
100 IU/ml Penicillin
0.1 mg/ml Sreptomycin
・50% WEHI conditioned medium
WEHI-3の培養上清に上記のRPMIを50 %加えたもの。必ずしも50 %である必要はなく、最適な濃度は各自検討してみると良い。WEHI上清はIL-3の供給源としている。
細胞の取り方
Bone Marrow-derived Mast Cell ( BMMC)
1. マウスを頚椎脱臼した後、外皮に切れめをいれ、外皮をはぎ腹膜を露出させる。
2. 下半身の皮をはぐ。
3. 股関節をはずし足をきりとる。
4. 膝関節をはずし大腿骨と頚骨に分ける。
5. 70%エタノールで湿らせたキムワイプで各々の骨についた筋肉をはぎ取る。
6. 各々の骨の両端を切る。(この操作からピンセットを用いて行う。）
7. 片足当たり10 mlのRPMI1640で骨の中を洗い、骨髄細胞を回収。
8. 1500 rpm で5分間遠心する（2回ほどRPMIで細胞を洗浄する）。
9. 上清を除去し50% WEHI を加える。
10. 細胞数を計測し、1x10E5 cells/mlになるようにまく。
11. 37℃で培養する。
注意事項（番号は上記の操作に対応）
1. 少し切れ目をいれ、指でひっぱるだけで簡単に外皮を剥ぐことができる。
3. この時足先もきる。
4. 筋肉もあらかた剥いでおくと以下の操作が楽である。この操作から培養室で行う。
5. 筋肉を剥いだ骨は70 %エタノールを吹きかけた6 cm dishにいれておく。
但し、あまりエタノールに曝しておくのもよくない。
7. 25Gの針をつけたシリンジを用いるとよい。
8. 混入した骨の破片などを除く。
10. 骨髄細胞は片足で 1x10E7個とれる。
培養の仕方
BMMC
細胞採取後1週間目に浮遊細胞を回収し、50% WEHI conditioned mediumを足して倍に希釈する。
2週間後に植えつぎを行う。この時、細胞濃度は1x10E5/ml になるようにする。
約4週間培養すると（mediumは3〜5日に1回足す）純化されたBMMCを得ることができる。
WEHI-3
上記RPMIに細胞濃度が1x10E5/ml になるようにまき、2〜3日培養する。
上清を回収し、遠心後上清をフィルターに通す。（この状態で-20℃で保存可能）