操作の安全性の点から、非放射性標識プローブを利用したISHである。実験の基本的な方法は放射性プローブと同様であるが、以下の点が異なるので、RI かnon-RIかは、実験の目的に合わせて選択するのがよいだろう。
--non RI in situ hybridizationの利点（RI ISHと比較して）
1.解像力が高い。
2.実験に要する時間が短い。（結果が早くわかる）
3.標識プローブの半減期を気にしなくてよい。
4.2種類のプローブを用いての二重染色が可能である。
5.RI施設外でできる。
--non RI in situ hybridizationの欠点（RI ISHと比較して）と解決策
1.組織や切片によっては、感度が低いことがある。
解決1）最初は少々のhigh backgroundを承知の条件設定からとりかかり、シグナルが充分確認できるようならhigh backgroundを減らすように条件をきつくして いくの が良い。
解決2）positive control をおいてシグナルの程度を比較する。
解決3）固定方法をかえる。固定時間を短くする。
パラフィン切片はproteinase K処理の条件をふる。
解決4）ハイブリの温度（Tmの求め方はRI ISHの項を参照のこと）、時間をかえてみる。
解決5）発色時間、温度を変える。（例；37℃/30min, room temp/1-2hrs, 4℃/overnight) ただ、経験上、room temp/30minでまったくシグナが認められない場合は条件をかえてもシグナルは見えません。）
解決6）プローブ濃度は濃すぎてもシグナルが出ないことがある。
2.組織や切片によって、あるいは過剰なプローブ濃度でhigh backgroundになることがある。
解決1）プローブ濃度を低くする。
解決2）切片の前処理でアセチル化やglycine処理を行う。prehybridization を行う。
解決3）prehybridization を行う。
解決4）hybridization bufferにyeast tRNA2% やBlocking reagentを入れる。
解決5）washの条件をきつくする。発色時間、温度を変える。
解決6）発色時間、温度を変える。（ちょうど良いところでストップすることが大切。光顕で観察しながら発色させる。）
3.対比染色でシグナルが減弱することがある。
解決1）一旦、発色反応をとめた時点で、対比染色前に水溶性封入剤で軽く封入し、 写真を撮って記録しておく。その後、微温湯にスライドを浸けて静かにカバー グラスをはずして対比染色をする。
解決2）シグナルが減弱するというよりも対比染色とシグナルの色調が似ていて重なると見にくくなる。コントラストがはっきりした染色を選択し、薄めに核染色あるいは対比染色をすると、写真でもきれいな像が得られる。
4.DIG標識プローブはDIGが疎水性のため、フェノール/クロロフォルム抽出できな い！！
解決1）tenplate DNAを充分精製する。
以下のprotocolは皮膚の切片について行ったDIG ISHである。
基本的にはBoeringer Mannheimの冊子を参考にしたが、backgroundの高い組織のため、washの条件や、組織の前処理はなるべくbackgroundを低くするような厳しい条件となっている。
組織、切片の調整、スライドグラスの前処理はRI ISHの項を参考のこと。
protocol全体の流れ
1.スライドグラスの乾熱滅菌 1`.プローブの作成
スライドグラス上標本の作製 プローブのラベリング
検体の脱パラフィン及び前処理、固定 プローブの変性
プレハイブリダイゼーション
2.ハイブリダイゼーション
3.洗い
4.免疫学的検出 4'.蛍光顕微鏡での観察
（直接プローブを蛍光色素でラベルした場合）
5.検鏡
template DNAの作成：RI ISHの項に準じる。プローブの長さは、150bpくらいが最もよいが、700bpまででも使用できるそうである。
プローブのラベリング
Boehringer Mannheim:DIG RNA labering kit (Cat.No. 1175025)使用。SP6/T7 RNA polymeraseを用いてin vitro transcriptionを行い、一本鎖のRNA probeが合成される。合成されたRNA probeにはnucleotide 20塩基から、25塩基に1分子の割合でDIG-UTPが入る。1 microgのtemplate DNA(760bpから以下のprotocol で10 microg RNA probeができるとされているが、template DNAのサイズや精製度によってかわり、5 microgくらいしかできないこともある。
RNA labeling
-mix the following to microtube on ice
Labeling buffer ;
template DNA 1 microg(0.05 microg/microl)
NTP labeling mix 2 microl
10x transciption buffer 2 microl
dH2O ~ total 20 microl
RNA polymerase(SP6,T7 orT3)2 microl (2U/microl)
total 20 microl
-incubate for 2hrs at 37℃
-stop the reaction with 0.2M EDTA(pH 0.8) 2microl
-precipitate the labeled RNAwith 2.2microl(0.1x vol) 4M LiCl
and 75maicrol (2.5-3.0x vol) cold(-20℃) ethanol
-vortex and place at -70℃ for 30min or at -20℃ overnight
-centrifuge at 13000g at 4℃ for 15min
-wash the pellet with 100 microl 70% ethanol
-dry and dissolve for 30min at 37℃ in 100microl (RNAase free) water
-store at -20℃
The amount of labeled RNA can be analyzed by agarose-gel electrophoresis and ethidium bromide staining. The transcript can estimate the yield from the ratio of DNA to RNA bands.
Labeling-efficiency check --ラベリング反応のあと、ラベル効率をチェックする。
・DIG nucleic acid detection kit(Cat.No.1175041 : Boeringer Mannheim)
・labeled control RNA(DIG RNA labeling kit vial 5 or Cat.No.1585746 : Boeringer Mannheim)
・positive charge nylon membrane( hybond-N+ nucleic acid transfer membranes : Amersham)
・buffer1;100mM maleic acid/NaOH(pH7.5 at 20℃ ) + 0.15M NaCl
・buffer2;1% Blocking reagent in buffer 1
・buffer3; 100mM Tris/HCl pH9.5 + 100mM NaCl + 50mM MgCl2
・NBT-solution, X-phosphate-solution; in DIG nucleic acid detection kit
・TE buffer(pH8.0)
-make a dilution series of labeled control RNA with RNA dilution buffer
( DDW: 20xSSC: formaldehyde= 5:3:2 )
labeled control RNA(20ng/ml start) final conc. of
or new sythesized RNA probe / RNA dilution buffer labeled control RNA
A 2 microl / 38 microl 1ng / microl
B 5 microl / 45 microl 100pg / microl
C 5 microl / 45 microl 10pg / microl
D 5 microl / 45 microl 1pg / microl
E 5 microl / 45 microl 0.1pg / microl
F 5 microl / 45 microl 0.01pg / microl
-mark spots on membrane with a pencil
-spot 1 microl B-F diluted solution onto the menbrane
-baking the membrane for 2hrs at 80 ℃
-wash in buffer 1 briefly at RT
-incubate in buffer 2 for 30min at RT
-dilute anti-digoxigenin-AP conjugate to 150mU/ml (1: 5000) in buffer 2 (diluted antibody
buffer).
- incubate in diluted antibody buffer for 30min
-wash in buffer 1, 2x15min
-prepare color-substrate solution with 45 microl NBT-solution, 35 microl X-phosphate-
solution and 10ml buffer 3 equilibrate membrane for 2min in buffer 3
-incubate membrane in color-substrate solution in the dark without shaking and check desired
spots (complete after 16hrs).
-stop the reaction with 50ml TE buffer for 5min
-dry at RT or baking
以上でRNA probeのできあがりである。頻回なfreeze/thawは避けるべきである。1回分づつmicrotubeに分注して保存し、1回で使いきったほうがよい。
いよいよ前処理したばかりの切片とhybridization 反応に進む。以下の過程では切片を乾かさないように気をつける。
prehybridization
-surround tissue by PAPPEN
-apply prehybridization buffer 80 microl~100 microl
-incubate for 2hrs at 45℃ in moist chamber(50% formamide in TEN buffer)
hybridization
-warm hybridization buffer to 85℃
- dilute probe(10x~100x) and mixing
- incubate for 3min at 85℃ (denature probe)
- apply probe buffer
- hybrididation O/N at 45℃
DIG-RNA probe buffer ; 1ng/microl
cold excess ; DIG-RNA probe 1ng/microl+ non labeling RNA probe 100ng/microl
or DIG labeling sense probe 1ng/microl で平行してISHを行う。
hybridization buffer stock
50% formamide 100%
5x SSC 20x
10mM Tris/HCl(pH7.5) 1M
1x Denhardt 50x
10% Dextran sulfate powder
0.02% SDS 10%
250μg/ml yeast tRNA 20mg/ml
2% Blocking reagent 10%
0.1% Sodium N-Lauroyl Sarcosinate 10%
overnightのhybridizationのときには、50% formamide/DDWの湿潤溶液を含ませたペーパータオルを湿潤箱にしいて（しっかりシールできる小さめの箱がよい）ふたをしてさらにサランラップで2重にくるんでインキュベーターに入れる。
wash
- 5x SSC at 45℃ for 3min
- 2xSSC+ 50% formamide at 45℃ for 30min
- 2xSSC at 45℃ for 20min
- 0.2xSSC at 45℃, 20min 2X
antibody reaction
DIG buffer 1 +0.3% Tween 20 5min
blocking in DIG buffer 2 60min
x1000 diluted anti-DIG antibody in DIG buffer 2 30min
DIG buffer 1+0.3% Tween20 15min
DIG buffer 3 3min
- apply solution( NBT45μl + X-phophate 35 μl in 10ml DIG buffer 3 )
- store in moist chamber
-check
- immerse in stop solution(10mM Tris-HCl pH8.0, 1mM EDTA) 3min
- wash with water *
-counter staining**
* ここで一度光顕で観察し、写真も撮っておいた方がよい。水溶性マウント剤を滴下し、カバーグラスをかけて撮影しておく。水溶性マウント剤は微温湯につけてしばらくすると溶けて、カバーグラスがはがれる。
**組織の構築がcounter stainingなしでも充分みえるときには、軽くヘマトキシリンで核染をするのみでよい。
buffer 1; 100mM maleic acid/NaOH(pH7.5 at 20℃ ) + 0.15M NaCl
2; 1.5% Blocking reagent, 10% sheep serum
50μg/ml yeast t RNA in buffer 1
3; 100mM Tris/HCl pH9.5 + 100mM NaCl + 50mM MgCl2