In situ hybridizationの結果の解釈
In situ hybridizationでは、得られたsignalの特異性を評価することが最も重要である。したがって対照実験が不可欠である。その方法として以下のものがある。
1) sense probeによる実験: antisense mRNAと相同なRNAが組織に無いという前提の基にnon specific signalを評価できる。しかしantisense mRNAが発現している可能性があること、組織によってantisense mRNAと相同なRNAが存在する場合があるので、sense probeがnegative controlにならないこともある。signalが全く出なければある程度意味を持つ。PAF受容体の場合、脳ではsense probeの方がsignalが強い！
2) excess cold: hot probeにcold probeを>100倍過剰となるように加える。pre-hybridizationとしてcold probeのみを先にhybridizeさせることもある。mismatch hybridの形成も競合阻害するのでnegative controlとして完全ではないが、最も信頼性が高い。
3) RNase pretreatment: hybridizationの前にRNaseで組織のRNAを分解しておく。hybrid形成以外のsignalを評価できるが、残存したRNaseがhybridization時にprobe自体を分解する可能性がある。
4) 異なったcDNA領域から作成した複数のprobeによる実験: 異なるprobeは異なるnon specific signalを生じさせることが多い。同一のsignal patternが得られればspecificityが高いと考えられる。
以上のように、単独で完全な対照実験はない。一般的なstringencyでexcess coldによる競合を確認し、さらに特異性を評価するためにwashのstringencyを振る実験を行なうことが望ましい。stringencyが高くなればmismatchによるsignalは減る。理想的には、stringencyを上げるに従ってsignalの絶対強度は落ちても相対的なpatternが変わらなくなる条件が定められるとよい(washのstringencyを高くするとspecific signalも減る)。さらに異なる領域から作成した複数のprobeで同様のsignalが得られればまず万全である。
手順
italicはAngererらのprotocolにある操作および注意点 (Angerer LM and Angerer RC: In situ hybridization to cellular RNA with radioactive RNA probes. In Wilkinson DG, ed.: In situ hybridization. A practical approach. 1992, Oxford Univ. Press)
* slide glasses の洗浄とcoating
slide glasseは、すでにcoating済みのものが入手できるが、大量に使用する場合は、下記のように自分でcoatingできる。
coating済みslide glasse
MATSUNAMI SUPERFROST micro slide glass
(PLLコート付/ s7441, APSコート付/ s8441）
スライドグラスも、カバーグラスもアルミホイルにくるんで乾熱滅菌。
（4〜6hrs）
自分でcoatingする場合--
1.洗浄
・大きなビーカーに中性洗剤と湯を入れ、ラックにいれたslide glassを浸す
（30 分。）
・流水（水道水）で5分。
・dH2Oですすぐ。
・dH2Oに浸してそのままオートクレーブ。
・冷えたらアルミホイルにくるんで乾熱滅菌。（4〜6hrs）
2.coating(poly-L-lysin solution:ｓigma)
染瓶に10倍希釈したPLLをいれ、slide glassを入れたラックを浸して室温で10分おく。水気を切って55℃、1~2hrs あるいは室温でO/N。乾いたらサランラップに包んでナイロンバッグに入れて4℃で保存する。
3.カバーグラスもアルミホイルにくるんで乾熱滅菌。（4〜6hrs）
1) Templateの調製
Miniprep DNAはフェノクロ抽出してもRNase Aが残存するので、proteinase K (100-200 micro g/ml, 30 min, 50｡C)で処理した上でフェノクロ抽出２回を行うことが望ましい。
Templateの部分はアルカリ分解をする場合、codingを含む1-2 kb、アルカリ分解しない場合、codingを含む150bp〜700bpがすすめられる。plasmid DNAの切断には5'突出か平滑末端となる制限酵素を用いる。complete digestionを確認して1 micro g/microlに調製。
2) cRNA probe 合成
RIに持っていくもの：
tube類, チップ類, 手袋, template, TE, milli-Q, EtOH, DTT, hydrolysis buffer, NaOAc, tRNA, 3NTP, 4NTP, RNA polymerase, Tx buffer, RNasin, ice box, Mupid, TAE buffer, agarose gel,
[bath 37｡C ]
hot cold
MAX script TM MEGA script TM (Ambion)
5x buffer 2 micro l 5 micro l
1M DTT 0.2 micro l 0.5 micro l
dH2O - 15 microl
RNasin (180 u/micro l) 0.1 micro l 0.2 micro l(final ~1u/micro l)
5 mM 3NTP 1 microl -
5 mM 4NTP - 2 micro l (final 0.4 mM)
template (1 micro g/micro l) 0.5 micro l 1 micro l
35S-CTP (70 micro Ci/micro l) 5 microl -
(35S-CTP 原液 ~54 ｵM, 比活性1000-1300 Ci/mmol)
RNA polymerase 0.5 micro l 1 micro l(10 u/micro lに希釈したもの)
final volume ~10 micro l 25 micro l
hot probeは全量10 microlで50-100枚分（比活性 = 1x109 cpm/micro gの場合）
cold cRNAは~5micro g/kbできる（10 u enzymeで10 nmolのnucleotideが取り込まれる）。
Angerer:
# DNA templateはtubeの側壁につけておき、すばやく混合する。
（局所的にDNA濃度が高くなるとspermidineがDNAを沈殿させることがある）
# polymeraseを加えた後は静かに指でtapして攪拌する。
# 最初にprobeを作成するときはtranscriptの長さを電気泳動で確認する。
# RNA polymeraseのKm値は12 mM (GTP)から60 mM (ATP)なので、
nucleotide濃度が50 microM以下になるとpremature terminationが起こりやすい。
# 500 nt以下の短いtemplateの場合は時間が長くかかる。
# templateがきれいでないとNTPの取り込み率は上がらない。(きれいなら40-80%)
polymeraseを追加すると取り込みが上がることもある。
Angerer: probeの比活性と濃度の目安
copy数の少ないmRNAの検出には比活性109 cpm/micro gのprobeを飽和プローブ濃度に近づけて用いる。飽和プローブ濃度は0.3 ng/micro l/kb (templateが1 kbなら3x105 cpm/micro l)である。一般的には1x105 cpm/micro l程度で行なう。
37｡C 1 hr（30 ｡Cではfull lengthが多くなるが取り込み率は若干落ちる）
[bath 60｡C on]
取り込みの確認 (50~90%)：
短冊状 (2 x 10 cm)のDEAE paperに0.5 micro lをdot →dryerで乾燥→2.2% 蟻酸アンモニウムで展開。
dotの部分と上方部のcount (Geiger)を比較して取り込みを評価する。
cold cRNAは電気泳動でcheck
DNaseI (Pharmacia, 5 u/micro l) を0.5 micro l (hot), 1 micro l (cold)を加え、37｡C, 10 min
hotには90 micro l TEDを加え、電気泳動のため0.5 micro lを分取
coldはhotと同様に長さの調整を行う。
probe lengthの調整 （アルカリ分解）
約150 bp (Angerer: 250 bp)がprobeの浸透性とhybridの安定性の点で最もよい。
10x hydrolysis buffer (11 micro l)を加える(total 111 micro l)
60｡C, t min
t = (L1 ﾐ L2)/(0.11 x L1 x L2)
L1: starting length, kb（full length of transcript）
L2: desired length, kb
t = 60ﾐ9/L1 (150 bpに調整)
t = 36ﾐ9/L1 (250 bpに調整) 1kb→0.2 kbなら36分
氷で急冷
15 microl 3M AcONa pH 5.2で中和
精製は以下のいずれでも可。
1.NENSORBｪで精製（付属のマニュアルを参照）
cartridgeを2 ml MeOHで洗う
2 ml Reagent Aで平衡化
中和したtemplate溶液に300 microl Reagent Aを加え、cartridgeに注ぐ
5 cc syringeで圧力を加えて流し出す (~1 drop/2 sec)
2 ml Reagent Aで洗う
2 ml milli-Qで洗う
1 ml Reagent Bで溶出し、最初の~300 micro lを採取。
2.Spin Spun Column (Clontech)
0.5 micro lをdot→乾燥→scintillation count→total radioactivityを概算する
finalで1x105 cpm/ micro lになるようにprobeのvolumeを決める。
Excess cold (100x)を含むprobeの作成
CTPとして35S-CTPのみを使ったprobe (105 cpm/ micro l)には0.1 ng/microlのhot cRNAが含まれるので~10 ng/ microlのcold cRNAを混ぜる。→probe 1 mlあたり10 micro gのcold cRNAを混ぜる。
Excess cold用に適当量(1/5~1/3)を別のtubeに取りcold cRNAを加える。
各々のtubeに
Add tRNA (20 mg/ml) final 250 micro g/mlとする (probe 1 mlあたり12.5 micro l)
ssDNA (10 mg/ml) final 250 micro g/mlとする (probe 1 mlあたり25 micro l)
エタ沈 (1/10 vol 3M NaOAc)
[bath 80｡C on]
80% EtOHでリンス
1M DTTに溶く final probe volumeの1/10 (final 1 mlなら100 micro l)
1 micro lをdotしてscintillation count→0.5 micro lを電気泳動のために分取。
ﾐ80｡Cで保存するか次に進む。
熱変性 80｡C, 5 min→氷水で急冷
probeをfinalの0.9 vol.の10/9x hybridization buffer (60 ｡C)に加える
3) 新鮮凍結切片あるいはパラフィン切片の作成
切片の固定条件は一定にすること。
1.凍結切片
1）大きな臓器や血管に富む臓器はPBS,4%PFA/PBSで潅流固定。
2）各臓器を切り出し、4%PFA/PBSに30分浸漬固定。
3）20％sucroseに試料が沈むまで４℃。
なお、1）、2）、3）は必須ではない。形態が保たれれば4）のみでよい。
4) OCT compoundに包埋。(MeOH - dry ice)で凍結。切片作成まで80｡Cに保存。
2.paraffin 切片
1）1.に同じ。
2）各臓器を切り出し、1cm3以下に細切し、4%PHA/PBSに2時間浸漬固定。固定時間が長くなる場合は、４℃で。
3) paraffinに包埋。
4) 切片の前処置
用意するもの：
乾熱した染瓶、乾熱した1ｌl瓶 (PBS, TEA用)、乾熱したスライドグラスラック
操作は素手では行わずdisposable globeを使用する。特に、スライドグラスは決して素手で触れないこと。
1. パラフィン切片の場合
deparaffinizaton
xylene for 10min
-100%EtOH for 2min
-100%-100%-90%-70%-30%EtOH quickly
-PBS for 5min X2
-0.2N HCl（RT, 20min)
-Proteinase K in 0.1M Tris/HCl(pH8.0) 50mM EDTA, 10microg/ml, at 37℃, 10min
-4% paraformardehyde /PBS at RT 20min
-2mg/ml glycin/PBS 15min x 2
-0.25% acetic anhydride in TEA buffer, 10 min
-dehydration 70% ethanol, 3 min
95% ethanol, 3 min
100% ethanol, 3 min
100% ethanol, 3 min
-Air dry, -80℃ store
2. 新鮮凍結切片, ﾐ80｡C保存
切片を室温に戻す（1-1.5hrs)
4% formaldehyde in PBS （用時調整), 10 min
wash in PBS, 2回
wash in dH2O
wash in TEA buffer（用時調整）
-アセチル化
0.25% acetic anhydride in TEA buffer, 10 min
あらかじめ染瓶に入れたTEA bufferにacetic anhydrideを注ぎ、
即座にラックを上下させて攪拌する。
Angerer: acetic anhydrideを乾燥した染瓶に入れておき、TEAと切片を同時に加えて攪拌、10 min静置、2x SSCで軽く洗浄
脱水 70% ethanol, 3 min
95% ethanol, 3 min
100% ethanol, 3 min
100% ethanol, 3 min
乾燥 Air dry（アルミホイルに包みovenで(< 60｡C)で乾燥させてもよい）
hybridizationに進むか ﾐ80｡Cで保存（アルミホイルに包みfreezer bagへ）
5) Hybridization
[bath 60｡C, oven 45-55｡C]
用意するもの：
probes, sections, moist chambers, moist chamber solution, KimTowel, autoclave bags, cover glass, forceps, 10 ml syringe, rubber cement, foil, gloves,
切片を室温に戻す (1-2 h前に)
probeを60｡Cに温める
moist chamberの底に50% formamide, 0.3M NaCl, 10 mM Tris, 1 mM EDTAを含ませたKimTowelを敷く
4 microl/cm2のprobeをsectionに載せてピンセットでcover glassを被せる
probe量の目安
18x18 13 micro 18x24 17 microl 18x32 23 microl
22x22 20 microl 22x32 28 microl 22x40 36 microl
Probeが切片全体に行きわたり気泡が入らないように、ゆっくりと密着させる。cover glassを圧迫しないこと。
Cover glassの周囲をrubber cementでsealする。
Slideをmoist chamberに入れ、chamberをさらにautoclave bagに入れsealする。ovenで加温。
Cover glassの代わりにparafilmを使ってもよい。parafilmの方が後で剥がし易い。ただし、20-30%多くのprobeを必要とする。
55｡C, 4-6 hr（剥がれ易いsectionは42｡C overnightとするがbackが高くなる）
hybridizationの過程でstringencyを高くするとhybridizeの効率が落ちるのでspecificityはwashで調整する。
6) WashとRNase A処理
[bath 45｡C on]
Rubber cementを剥く。この時cover glassをずらさない。
以下、RNase処理時を除いて還元剤b-ME (10 mM: 70microl to 100 ml)を加える。
酸化した35Sはhigh backgroundの原因となる。
4x SSC +b-ME , 45｡Cにslide glassを漬ける(20x SSC, 20 ml to 80 ml water)。
Slide glassを溝付きの染瓶に直接入れる。cover glassは自然に外れる。
cover glassが外れたらrackに入れる
4x SSC +b-ME, 室温 1 hr ~ overnight
Angerer: 4x SSCと10 mM DTTの入ったCoplin jarにslideを移し3~4回液替え
2x SSC+b-ME 60｡C, 1 hr (11 ml 20x SSC in 100 ml water)
(2x SSCに移してからbathに入れ60｡Cまで加温する)
[bath 37｡C on]
Angerer: ここでbackgroundを減らす目的でoptinal high-stringency washを行なう
30% ethanol w/ 0.3M ammonium acetate
50% ethanol w/ 0.3M ammonium acetate
70% ethanol w/ 0.3M ammonium acetate
95% ethanol
99% ethanol（２回）
Air dry
hybridization buffer (50% formamide, 0.3 M NaCl, 20 mM Tris-Cl, 1 mM EDTA, pH 8.0 + 10 mM DTT)で50~65 ｡C, 15 min
3~4 ｡C刻みでstringencyを変えてhybridの特異性を評価する
2x SSCで軽く洗浄 (室温)
このoptional washは脳切片の白質部に非特異的なprobeの付着を起こした(50｡Cよりも60｡Cで顕著)。
原因不明。少なくとも脳では行なわない方がよいだろう。
20microg/ml RNase A 37｡C, 30 min (10 mg/ml RNase A 200 microl in 100 ml TEN)
この過程ではb-MEを入れない。RNase用の染瓶は専用にする
[bath x｡C on]
TEN+b-ME, 37｡Cで5 min洗浄 (rackを上下に揺する)
2x SSC+b-MEで5 min洗浄（液替えして4回）(60 ml 20x SSC to 540 ml water)
RNase Aは後の0.1x SSC wash (>60｡C)でRNA-RNA hybridを分解しうるので、可能なかぎりRNaseを洗い落とす必要がある。
0.1x SSC+b-ME, x｡C, 1 hr (0.5 ml 20x SSC to 100 ml water)
予備実験で温度 (x｡C)を60｡C, 63｡C, 66｡C, 69｡Cのように振ってみる。non specific signalはより低温で減弱し、specificなsignalはより高温まで残る。non specificが充分抑えられ、かつspecificなsignalが残る温度を見つける。
67｡Cくらいまでなら coating slideで脳の切片が剥がれることはまずない。眼などは剥がれ易い。こまめに切片を観察し、剥がれかけたら止める。
塩濃度と温度の関係 (Tmの計算式から)
0.1x SSC/ x ｡C と以下の条件は同一のstringencyをもつ。
0.07x SSC/ xﾐ3 ｡C
0.05x SSC/ xﾐ6 ｡C
0.01x SSC/ xﾐ18 ｡C
Angerer:
TEN+10 mM b-ME, 37 ｡C, >30 min, 4~5 changes (1000 ml/10 slides)
2x SSC w+10 mM b-ME, 4~5 changes, 15 min each (total 1000 ml)
0.1x SSC (RNA-free+10 mM b-ME), 50 ｡C, 15 min (500 ml/20 slides)
室温まで冷却
脱水 75% ethanol, 0.3 M ammonium acetate, 3 min（剥がれ易い）
95% ethanol, 0.3 M ammonium acetate, 3 min
100% ethanol, 3 min
100% ethanol, 3 min
7) Autoradiography （湿気を避けることが肝心）
film (Amersham b-Max)を室温に戻す。
film: slideを切片が上になるようにして厚紙の上に並べ、テープで固定
カセットに入れ、暗室へ。
乳剤側 (ツヤがない方)をslide glassに密着させる。
上に厚紙を乗せカセットを閉める
2~10日露光, 4｡C（乾燥剤を添えてビニル袋に入れsealする）
FujiBASの場合は12~24 h。imaging plateを汚染しないためラップを挿む。ラップには油脂がついているので、切片にあたる側はキシレンなどできれいに拭いておく。
現像
D-19, fixerを4｡Cから出して室温に30 min放置
Kodak D-19 2-3 min 16-20｡C
fixer 5 min
tap water >30 min
(Fixer, Super FujifixまたはNa2S2O3-5H2O 250-300 g + water to 1000 ml)
Emulsion autography:
slideの脱脂処理 (省略可？)
1. 95% EtOH 5 min（溶液はすべて新しくきれいなもの）
2. absolute EtOH 3x 5 min
3. xylene 5 min
4. xylene 30-60 min (脱脂)
5. absolute EtOH 3x 5 min (#2の溶液を使用)
6. Air dry 30 min (埃を防ぐこと)
Dipping
[bath 40｡C on]
1. 必要なemulsion溶液の量x (ml)はx=N/5+10で求める (N=slide枚数)。この量で十分余裕がある。x/2 mlの dH2O (Angerer: 0.6 M NH4OAc)を50 ml tubeに入れ40｡Cのwater bathで暖める。x mlの目盛に印を付けておく。
2. emulsionが新品、あるいは1か月以上使っていない場合、きれいなプラスチックの匙で表面の膜を取り去る。酸化している部分を使うとbackgroundが高くなる。
3. gelを少しずつかきとってtubeに入れる。（液面が印に達するまで）機械的な摩擦もgrainを生じさせるので、gelはできるかぎり丁寧に扱う。
4. tubeをbathに戻す。10 min静置
5. dH2Oをdipping chamberに入れてbathで暖める。bathの水が入らないようにfoilで覆う。
6. emulsionが溶けたらtubeを上下にゆっくり約10回ひっくり返して混ぜる。最初に逆さまにした時、塊が見えるようならtubeをbathに戻してさらに5 min置く。完全にemulsionが溶けていることを確認する。泡を完全に防ぐことはできないが最小限に抑えるよう努める。tubeを5 min静置して泡が表面に浮くのを待つ。
7. 待っている間にslideをdipする順番に並べる、tube rackを用意する、test用のきれいなslideを用意する。
8. dipping chamber内の水を捨て、chamberをbathに戻す。
* tubeやchamberをbathから取り上げる時は外壁を拭うこと。
9. emulsionを静かにdipping chamberに注ぐ。5 min静置して泡が表面に上がるのを待つ。pipetを使ってもよい。
10. きれいなtest slideをdipして泡を観察する。泡が無くなるまで数枚dipする。
11. 標本slideをdipする。ゆっくりと同じ速さで垂直に引き上げる。5 secほどpaper towelにslideの下端を乗せて余ったemulsionを吸い取る。
12. 最初と最後にblank slideを2枚dipしておく。1枚は光を当ててcoatingの均一さと泡の評価に用いる。もう1枚は標本slideと一緒に現像してbackgroundの評価に用いる。
13. slideを遮光箱(金属製の薬品箱が適当)に入れて2-4 h乾燥させる。50枚以下のslideの場合、時間は2 hが適当である。蓋を黒のビニルテープでsealする。箱は暗所(流しの下など)に置く。
14. 乾いたslideを取り出して黒いslide boxに収納する。silica gelなどの乾燥剤を入れておく。sealしてboxをfoilで包む。4｡Cで保存する。
現像
1. slide boxを冷蔵庫から取りだし室温に戻す。1-1.5 hを要す。
2. D-19, dH2O, rapid fixを4｡Cから出し室温で14℃程度まで暖める。
*D-19は2-3 wで変性する。rapid fixは安定。
3. slideをrackに入れる。emulsionの表面に触れないよう注意する。
4. D-19 3.5 min, 14｡C (揺すらない) signalが弱いときは17｡C, 3 min
5. dH2O 15 sec（揺すらない）
6. Super Fujifix 3 min
7. dH2Oでリンス 1 min
8. tap waterでリンス >30 min (~45 min)
Angerer: 2% 酢酸で停止 (10 sec, 15 ｡C)→Kodak Fixerで定着 (15 min, 15 ｡C)
冷流水で洗浄 (30 min)
Counter staining: 組織、目的に応じて染色法を選ぶ。Nissl, HE, etc.
Nissl staining
Dehydrate in 30% EtOH 3 min
50% EtOH 3 min
70% EtOH 3 min
95% EtOH 3 min
100% EtOH 3 min
100% EtOH 3 min
Rehydrate in 95% EtOH 3 min
70% EtOH 3 min
50% EtOH 3 min
30% EtOH 3 min
Stain in cresyl violet 30 sec
Destain in 70% EtOH 5 sec
95% EtOH 5 sec
100% EtOH 5 sec
100% EtOH 5 sec
50% EtOH + 50% xylene 10 sec
100% xylene 10 sec
100% xylene 10 sec
Mount in DPX mountant (Fluka 44581)
Negative controlのためのRNase処理
新鮮凍結切片
100 ｵg/ml RNase A in PBS, 37｡C, 30 min
4% pafarformaldehyde/PBS, 室温, 15 min
wash in PBS
wash in PBS
dehydrate and acetylate（他の切片の処理が全部済んだ後に）
Appendix
試薬：
probe作成にはRNase freeのものを用いる。切片のpre-hybridization処理もできるだけRNase freeで行なう。hybridization後はRNase freeの必要はない。
器具：
ガラス、金属器具は原則として乾熱処理を行なう。hybridization後に用いるものについては必要ない。ただしRNase Aに触れたものは必ず乾熱処理を行ない、hybridization前には使用しない。染瓶でRNase Aを用いるので、RNase Aのcontaminationに細心の注意を払う必要がある。disposableの手袋を頻繁に換える、RNaseを含む溶液を染瓶で扱う時には溶液がこぼれたり外壁に垂れないように注意する。机の上には紙を敷き、溶液を捨てるときには染瓶にtissue paperをあてがうなど気を使う。
水：
DEPC処理は不要。milli-QでOK。
1M Tris-Cl 60.55 g Tris-base in dH2O HClでpH 7.5
室温まで戻して再びpHを合わせる→to 500 ml
10% SDS 60 ｡C, 1 hr, filtrate
0.5 M EDTA 93.05 g Na2EDTA-2H2Oを約400 mlの水に加え攪拌
固形NaOH 約10 gを加えてpH 8.0, 500 mlとする。autoclave
1 M DTT 3.09 g/20 ml dH2O filtrate→小分けしてﾐ20 ｡C保存。
autoclave不可。
NTP 100 mM solution (Pharmacia)
3 M AcONa 81.62 g NaOAc-3H2O in dH2O
pH 5.2 with AcOH→to 200 ml
20x SSC
NaCl 175.3 g (final 3 M) sodium citrate 88.2 g (final 0.3 M)
→1000 ml with dH2O, pH 7.0 with HCl or NaOH, autoclave
PBS (10x) NaH2PO4-2H2O 30 g
K2HPO4 140 g
NaCl 80 g
→to 1000 ml with dH2O, pH 7, autoclave
TED 10 mM Tris-Cl (pH 7.4)
1 mM EDTA
20 mM DTT
50x Denhardt BSA (fraction V) 1% (1x: 0.02%)
polyvinylpyrrolydone1% (1x: 0.02%)
Ficoll 400 1% (1x: 0.02%)
filter and ﾐ20 ｡C保存（1か月以内に使用するのが望ましい）
あるいはSigmaの製品 (molecular biology grade)
Hybridization buffer (10/9x) final conc.
100% formamide 5ml 50%
20x SSC 1 ml 2x
1 M Tris-Cl 100 ｵl 10 mM
50x Denhardt 200 ｵl 1x
50% dextran sulfate 2 ml 10%
10% SDS 200 ｵl 0.2%
dH2O 600 ｵl
total 9 ml
10x hydrosis buffer 0.4M NaHCO3,(0.34 g/10 ml)
0.6M Na2CO3 (0.64 g/10 ml)
pH 10.2（小分けにして冷凍、pHが変わりやすいので新しいものを使う）
5x transcription buffer (Tx buffer, polymeraseに付属、変性しやすい)
200 mM Tris-Cl, pH 8.25（pH 7.6と比べて2-3倍効率がよい）
30 mM MgCl2
10 mM spermidine
500 microg/ml BSA
3NTP ATP, GTP, UTP 各5 mM（希釈）
4% formaldehyde/PBS（用時調整）
37% formalin 32.4 ml + 10x PBS 30 ml → 300 ml with water
TEA (用時調整)
NaCl 9 g (final 0.9%)
triethanolamine 15 g (13.5 ml) (final 0.1 M)
→to 1000 ml with dH2O, pH 8.0 with ~4.0 ml HCl (36%).
TEN 10 mM Tris-Cl・1 mM EDTA・0.5 M NaCl, pH 8.0
Reagent A for NENSORB
100 mM Tris, 10 mM triethylamine, 1 mM EDTA
(Add 14 microl triathylamine to 10 ml 100T1E; 混ぜると~pH 7.7になる。
ならないときは2N HClで合わせる)
Reagent B for NENSORB
20% n-propanol or 5% butanol
NTB2用の安全灯
本体 (Kodak純正) Adjustable safelight lamp, model B (11200円) または
Utility safelight lamp, model D (16340円)
フィルター Safelight filter No.2（国内在庫なし）4650円(f 5.5 inch, for model B)
10830円 (10x12 inch, for model D)
国産品では高感度オルソまたはリスフィルム用が使える(ハンザ、キング etc)。